實驗名稱：Spore stain

實驗原理：

　　因為孢子類似抗酸菌很難被染色。如用普通染色法則菌體是深色，孢子卻因染不上而呈現透明。所以，要採用Wirtz-Conklin method染孢子，染上色後將如同結核菌一樣無法用脫色劑脫色。

實驗目的：

　　觀察Clostridium tetani(破傷風桿菌)和Clostridiumsporogenes經過Spore stain後所呈現的形狀。

實驗材料：薄抹片、malachite green(5%)、火焰、Safranin、油鏡。

實驗方法：Wirtz-Conklin method如下：

1. 製作薄抹片，加入malachite green(5%)。
2. 用火焰在其下慢慢輕輕地燒，見其產生白煙，稍微移開後再燒。如此持續5min.，促使孢子上色。
3. 背面沖水後，將水甩掉。
4. 用Safranin(番紅)做背景染色30sec.。
5. 背面沖水後，在空氣中待其乾燥。
6. 用油鏡鏡檢。　

實驗結果：孢子的地方染上綠色後即不易脫色，其他地方則呈現背景顏色(紅色)。　

Clostridium tetani(破傷風桿菌)形成terminal spore，狀似鼓棒(drum stick)。Spore處是綠色，桿狀處是紅色。

Clostridium sporogenes猶如糖果狀，中央孢子處是綠色，兩旁是紅色。　

實驗討論：

　　Clostridium tetani (破傷風桿菌)除了可以用鏡檢外還可用體外隔離，不過這兩種方法都不是很成功。Clostridium sporogenes和Clostridium tetani一樣在鏡檢下也不是很成功，通常是因為孢子不易染色的關係。　

　　Clostridium tetani和Clostridium sporogenes都是厭氣菌，為了作為實驗材料而培養時，用豬肝、豬肝湯再經高溫、高壓滅菌作為medium的效果很好(可能是因為養分充足，有glutathione，作用類似cystine、arginine為還原劑，可將O₂鎖住的關係)。　

　　Clostridium tetani可以從臨床上來診斷，病人通常有傷口、牙關緊閉(由於三叉神經運動分支障礙，導致咀嚼肌強直，病人的嘴不由自主地緊閉，稱為trismus或lockjaw)、且曾有免疫缺失的情況。若直接從傷口取出Clostridium來做抹片染色的材料，並不能確認一定是C. tetani。所以取出後可以直接在blood agar或轉移到cooked meat medium(加熱80⁰C，10~15min.以破壞非孢子物)。在blood agar經過24小時的培養後，將發現呈現聚集的情況(因為C. tetani是有運動性的)。　

　　經過Spore stain後，將發現猶如網球拍狀的terminal spores。　

　　進一步的確認是藉由偵測它的neurotoxin產物。方法是從C. tetani的純培養液中抽取濾液並注射到老鼠腿中，另一隻則多加了tetanus antitoxin。幾個小時後，未受保護的老鼠腿部出現僵硬和肌肉痙攣並延伸到尾部，然後到另一條腿上。受保護的老鼠則倖免於難。　

　　Clostridium sporogenes是一種非致病性的細菌。它通常和Clostridium perfringens (Welch's bacillus)，Clostridium novyi，和Clostridium septicum等細菌一起存在。它們如同腐生菌般存在於土壤和人及動物的腸道。當傷口接觸到被糞便汙染的土壤，感染就發生了。大部分絕對厭氧、產毒、可形成孢子的G(+)細菌便會感染傷口而造成一種致命的疾病，我們稱為Gas gangrene(氣性壞疽)或Clostridial myonecrosis、Clostridial myositis。有75%與Cl. perfringens相關，1/3是以Cl. perfringens為致病原。

參考文獻

　　Spore stain•微免實驗手冊•p58。

　　Boyd R.F., Hoerl B.G.(1986).Basic medical microbiology.(3rd edition,pp498-499).Boston/Toronto: little, Brown and Company.

　　Alice. Lorraine. Smith(民67初版)•Principles of Microbiology(8版，p407)•台北：南山堂。

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