實驗名稱：T.B. bacilli & Acid-Fast Stain
實驗原理：
Acid-Fast Stain是一種重要的鑑別法，適用於染細胞壁有蠟狀物質(游離脂質)的細菌。微生物學家用Acid-Fast Stain來確認Mycobacterium屬，包括有Mycobacterium tuberculosis和Mycobacterium leprae及一些不知名、不規則的Mycobacteria。除了染這種菌外，它也可以染actinomycete中的Nocardia asteroides complex。
實驗目的：了解抗酸性染色法，並觀察結核菌的形態，及其病症之探討。
實驗材料：抹片、Carbolfuchsin sol.、acid-alcohol、methylene blue、油鏡。
實驗方法：Acid-Fast Stain又稱為Ziehl-Neelsen Method，步驟如下：
- 作抹片並予以固定。
- 加入Carbolfuchsin sol.(紅色)並用火在其下緩慢地燒(切勿烤焦)大約5 ~ 10 min.。(染料要完全覆蓋在 Slide。)
- 冷卻、沖水(現在所有的細菌都是紅色。)
- 用酸性酒精(acid-alcohol)重複滴到紅色從抹片上移除。沖水。(在這個步驟，非抗酸菌的紅色被酸所移除，但是抗酸菌仍保留紅色。)
- 用methylene blue來做背景染色30 sec.(因為抗酸菌已完全被紅色的carbolfusin所填滿，它們不能再接受任何背景染色；至於非抗酸菌原來的染色已被酸移除，所以現在染成深藍色。)
- 沖水待乾，用油鏡來鏡檢。
簡單地說，加熱使得紅色的carbolfuchsin可以穿透並可保留這個染料。至於acid alcohol是一種脫色劑，非抗酸菌的紅色被移除；而抗酸菌因為有一層蠟狀脂肪，使得carbolfuchsin比acid alcohol更為可溶而不易脫色。
實驗結果：Mycobacteria呈現紅色，而背景則是藍色的。
Mycobacterium tuberculosis一般呈現帶狀，在某些情況下會是纖維狀、黴菌樣，這也是稱做myco.的原因(myco在希臘語是黴菌的意思。)
實驗討論：
T.B.菌在培養上是先取得病人的第一口痰，再加2%NaCl或4%KOH做離心，然後用buffer來培養。(因為結核菌可耐短暫的鹼，所以當加入2%NaCl或4%KOH可去除一些快速生長的雜菌。)
在傳統上是利用egg-based(e.g.,Lowenstein-Jensen亮綠色)和agar-based (e.g.,Middlebrook)培養基。用tube做slant media(斜面培養基)，再加入一些染料(例如孔雀線)來抑制其他細菌的生長。最後我們可以發現它的菌落形態是粒狀凸起。
為了縮短偵測時間，近來改用了特殊營養的肉湯培養基來取代egg-based media.
結核病是由Mycobacterium tuberculosis所引起的，它是一種細長桿狀且必須要有氧氣的細菌。這種桿菌生長緩慢(20 hour一代)，有時會形成纖維狀且聚集在一起。在液態培養基的表面，它們看來像黴菌樣，這也是它名稱的由來。
T.B.菌用Ziehl-Neelson或Kinyoun法染色時，由於acid alcohol無法脫色，所以被歸類為acid-fast。這是因為它們有一層脂肪物質，而這層脂肪也可能是抵抗環境壓力(如乾燥)的主因，它們甚至可以在乾痰中存活數週也可忍受化學環境。
一般而言，潛伏的T.B.菌是不易被察覺的，但是若防衛失敗，它所引起的疾病又將是很容易察覺。通常得結核病的人是本身即有其他疾病的存在，且受到物理和環境因子(如營養不良、過分擁擠、壓力)所影響。
結核病常由吸入結核菌所引起，只有肺部達1/3的細菌才會引起肺泡內的macrophages來吞噬。若是健康的人通常可以破壞細菌，假如不是，在化學和免疫防衛之下，結核菌仍可在macrophages存活且增生。
當macrophages溶解後，便將病菌釋出。引起了過敏反應來對抗微生物，tubercule也就形成了。結核病人此時形成小塊，包括了組織細胞的包裹物質和細菌的分解產物及白血球，也通常有壞死中心。此時，細菌很少存在於tubercule內。
其實T.B.菌並不產生任何有傷害性的毒素，組織的損傷則是由過敏應所引起。過敏反應持續地發生，最後便形成乾酪壞死(組織分解後產生高分子量看似乾酪的脂肪物質)。如果復原後，將會鈣化，在X-ray下呈現透明狀，我們稱為Ghon complexes。
但是如果沒好，可能會更進一步地液化壞死(liquefaction)，而且會形成空氣充填的結核腔 (tuberculous cavity)。
為了預防結核病的發生，我們用BCG來當疫苗。它是一種用牛群Tb桿菌(M.bovis)培養篩選的減毒疫苗，將它施打給較年輕的人會很明顯降低Tb的發生率。但是它也有一些缺點：如不能用在免疫疾病病人；打BCG後作skin test會是(+)；有可能會引發皮膚形成肉芽腫等。
參考文獻
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