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一、題目:ELISA

二、原理及目的:

酵素連結免疫分析法已日益普及,因為非常靈敏且不必如免疫螢光術和放射免疫分析法需要特殊設備。此法的原理是以一種酵素連結到抗原或抗體上,用酵素活性來做為定量標記。有許多方法已經架構完成,視使用的酵素性質及待測的抗原-抗體系統而定。其中廣泛使用的便是酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assayELISA),可以測定抗原或抗體。

ELISA適用於許多病毒的診斷及確認。

三、材料及方法:

1.材料:(Solid-phase

2.方法:(如圖所示)

四、結果:

1.Antibody sandwich immunoassay(測Ag):

 

2.Indirect antibody capture immunoassay(測Ab):

五、討論:

ELISA是在1971年首次由EngvallPerlman所介紹。

不論是測抗原或抗體都有很高的敏感性及專一性,且使用設備相較之下少了許多。固相吸附准許unbound reagents快速且完全地清洗。是一種安全又穩定的方法。

若要測定抗原,則以一已知特定抗體結到固相之上,含有抗原之待測物加入後,沖洗掉多餘部分,再加入第二種有酵素標記的抗體。此試驗中的抗原至少要有二個決定部位。洗去第二種抗體後,加入基質,用色度計估計酵素活性,此濃度與抗原濃度有關。

偵測Ag的方法有兩種:Antibody sandwich immunoassay(即加入Ab再加Ag最後是Ab)及Antibody capture immunoassayCompetition assay)。我們要談的是抗體三明治免疫分析法:首先是Ag專一性的primary Ab的吸附到塑膠盤,此時洞被高濃度的非專一性蛋白所填充(Bovine serum albumin, gelatin, skim milk, or gamma-globulin)。接著加入樣本抗原;那些沒有接合到primary Ab的都被沖到了。最後則是加入有酵素標定的secondary Ab,再洗掉多餘的受標定抗體。留下的受標定抗體被額外的酵素受質所加入,然後我們用1NH2SO4來終止反應。(上述實驗的沖洗液為Tween 20)。

若要測定抗體,則使已知特定抗原固結於某種固相(如塑膠杯或microplate),與待測液血清的稀釋液一起靜置。加進某種特定受質,即可測出酵素活性;變色反應可用色度計(colorimetry)來估計。酵素反應是結合抗原的抗體量的直接函數。包括有Antigen capture immunoasssayIndirect antibody capture immunoassay.

ELISA在臨床診斷學上的應用包括:德國麻疹抗體之測定;CMVHSVmeaslesmumpsVZV等病毒抗體測定。HIV抗體測定(Rapid ELAVIASERODIA-HIV)及C型肝炎病毒抗體測定(C型肝炎病毒亦可用PCR來測定)。

最後就是判讀結果,在SERODIA-HIV中,紅色顆粒凝聚成一個小紅點沉落盤底,上清液為透明狀即為陰性。若紅色顆粒均勻散布於溶液之中,不會聚集成一紅點,呈混濁狀,即為陽性。若介於中間須重做,再次得同樣結果則要用西方點墨法來做確認。

六、參考文獻:

Jacquelyn G. Black (1993).Microbiology principles and Applications.(2).Prentice hall, Inc.

王聖予、李麗俐等譯(民85)•免疫學(4版)•台北市:藝軒。

呂玉華(民76)•微生物學•台北市:合記。

李國鏞博士編著(民81)•普通微生物學•台北市:九州。

許秉寧編譯、蔡惠芳協譯(民78)•醫用生物學上冊(17版)•台北市:南山堂。